研究背景

鐵死亡（Ferroptosis）是一種由鐵依賴性脂質(zhì)過氧化驅(qū)動的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式，近年來被證實與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，特別是在腫瘤領(lǐng)域。鐵死亡的調(diào)控涉及多個因素，其中NRF2是一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄共激活因子，通過調(diào)控其靶基因（如GPX4）來抑制鐵死亡。此外，CLDN6（緊密連接蛋白6）作為一種重要的腫瘤抑制因子，在乳腺癌中的表達(dá)下調(diào)，且與鐵死亡的關(guān)聯(lián)尚未明確。本研究旨在深入探討CLDN6與鐵死亡之間的聯(lián)系，并揭示其在乳腺癌中的潛在調(diào)控機(jī)制，以期為乳腺癌的預(yù)后預(yù)測和治療提供新的視角和靶點。

研究內(nèi)容

實驗結(jié)果總結(jié)

（一）CLDN6與鐵死亡的預(yù)后意義

研究團(tuán)隊通過下載GEO中乳腺癌數(shù)據(jù)，分析CLDN6發(fā)現(xiàn)其在正常乳腺組織中高表達(dá)，而在乳腺癌組織中低表達(dá)。通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA），發(fā)現(xiàn)與CLDN6共表達(dá)的基因主要富集在鐵死亡、谷胱甘肽代謝和磷酸戊糖途徑中。此外，CLDN6的表達(dá)與鐵死亡評分呈正相關(guān)，且低CLDN6表達(dá)的患者NRF2表達(dá)更高。TCGA和乳腺癌組織微陣列（TMA）中展現(xiàn)出強(qiáng)大的預(yù)后預(yù)測能力，優(yōu)于單獨的CLDN6表達(dá)或鐵死亡評分。

（二）CLDN6觸發(fā)乳腺癌細(xì)胞中的鐵死亡

細(xì)胞功能實驗驗證（MDA-MB-231和MCF-7），CLDN6的過表達(dá)抑制了乳腺癌細(xì)胞的活力和克隆形成能力，且這種抑制作用可通過沉默CLDN6恢復(fù)。CLDN6過表達(dá)的細(xì)胞對多種鐵死亡誘導(dǎo)劑（如索拉非尼和RSL3）的敏感性增加，且這種敏感性增強(qiáng)可被鐵死亡抑制劑Fer-1逆轉(zhuǎn)，而壞死抑制劑NSA或凋亡抑制劑Z-VAD-FMK則無此效果。在超微結(jié)構(gòu)和生化水平上，CLDN6過表達(dá)導(dǎo)致線粒體體積減小、膜密度增加，同時活性氧（ROS）和脂質(zhì)過氧化增加，谷胱甘肽（GSH）水平降低，這些變化可被Fer-1逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明CLDN6能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

（三）CLDN6通過AKT/GSK3β/FYN軸促進(jìn)NRF2核輸出誘導(dǎo)鐵死亡

進(jìn)一步富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要富集在緊密連接、鐵死亡、脂肪酸生物合成、谷胱甘肽代謝和NRF2通路中。預(yù)測NRF2可能是CLDN6和鐵死亡之間的關(guān)鍵所在。實驗結(jié)果顯示，CLDN6不改變NRF2 mRNA水平，但降低了NRF2及其靶基因（包括GPX4和G6PD）的蛋白水平，并減少了NRF2在細(xì)胞核中的蛋白水平和定位。這些結(jié)果表明CLDN6抑制了NRF2的激活和核定位。研究還發(fā)現(xiàn)，CLDN6降低了AKT在Ser473位點的磷酸化水平和GSK3β在Ser9位點的磷酸化水平，同時增加了核內(nèi)FYN的表達(dá)，暗示CLDN6可能通過AKT/GSK3β/FYN軸促進(jìn)NRF2的核輸出。

（四）CLDN6通過PBK調(diào)節(jié)AKT/GSK3β/FYN軸

研究發(fā)現(xiàn)，CLDN6不顯著影響PBK的mRNA水平，但降低了其蛋白表達(dá)。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）介導(dǎo)的降解在PBK蛋白穩(wěn)定性中起著重要作用。實驗顯示，CLDN6不改變經(jīng)蛋白酶體抑制劑MG-132處理后的PBK蛋白水平，但顯著縮短了PBK的半衰期，并在蛋白酶體降解被抑制時增加了PBK的泛素化水平，表明CLDN6通過UPS加速了PBK的降解。PBK過表達(dá)增加了AKT和GSK3β的磷酸化水平，并降低了核內(nèi)FYN的水平。此外，PBK增加了總蛋白、核蛋白、NRF2的核定位以及G6PD和GPX4的表達(dá)。使用NRF2抑制劑ML385后，發(fā)現(xiàn)CLDN6和PBK過表達(dá)的細(xì)胞中NRF2、G6PD和GPX4的表達(dá)降低。進(jìn)一步結(jié)果表明，PBK降低了對多種鐵死亡誘導(dǎo)劑、ROS和脂質(zhì)過氧化物水平的敏感性。這些發(fā)現(xiàn)表明CLDN6通過PBK調(diào)節(jié)AKT/GSK3β/FYN軸，誘導(dǎo)NRF2介導(dǎo)的鐵死亡。

（五）CLDN6與DLG1/PBK復(fù)合體的相互作用需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑

PBK的亞細(xì)胞定位對其功能至關(guān)重要，而CLDN6與PBK在細(xì)胞膜上共定位。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞膜的運輸和循環(huán)需要VPS35和SNX27的參與。研究發(fā)現(xiàn)，CLDN6促進(jìn)了PBK與VPS35陽性retromer復(fù)合體和SNX27的共定位，表明CLDN6通過促進(jìn)retromer復(fù)合體介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑將PBK運輸?shù)郊?xì)胞膜。通過共免疫沉淀實驗發(fā)現(xiàn)PBK與CLDN6具有結(jié)合親和力。結(jié)構(gòu)分析顯示，CLDN6和PBK均含有PBM，而DLG1含有三個PDZ結(jié)構(gòu)域。通過分子對接發(fā)現(xiàn)CLDN6的PBM與DLG1的PDZ結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定結(jié)合。實驗結(jié)果表明，CLDN6不增加DLG1的表達(dá)，但能與DLG1結(jié)合，并在細(xì)胞膜上共定位。這些數(shù)據(jù)表明CLDN6招募DLG1/PBK復(fù)合體到細(xì)胞膜。為了闡明CLDN6的PBM在連接DLG1和PBK中的作用，研究團(tuán)隊在乳腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了缺乏PBM的CLDN6。結(jié)果表明，缺乏PBM的CLDN6不再與DLG1或PBK共定位，且不影響PBK蛋白水平，也無法與DLG1或PBK結(jié)合。這強(qiáng)調(diào)了CLDN6的PBM在招募DLG1/PBK復(fù)合體中的不可或缺性。這些結(jié)果為CLDN6通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑招募PBK并與DLG1/PBK復(fù)合體結(jié)合提供了證據(jù)。

（六）CLDN6在體內(nèi)誘導(dǎo)乳腺癌鐵死亡

為了評估CLDN6對鐵死亡的影響，研究團(tuán)隊建立了裸鼠皮下異種移植瘤模型。結(jié)果表明，CLDN6過表達(dá)組的腫瘤體積和重量均小于對照組，且索拉非尼處理加劇了這些變化。通過透射電子顯微鏡（TEM）觀察到，CLDN6導(dǎo)致線粒體膜密度增加和脂滴增加，以及線粒體嵴減少，這些變化在索拉非尼處理后更為明顯。這些結(jié)果表明CLDN6在體內(nèi)誘導(dǎo)鐵死亡。異種移植瘤組織的IHC染色和WB檢測顯示，CLDN6過表達(dá)和索拉非尼處理組的NRF2和GPX4表達(dá)低于對照組。IF染色顯示CLDN6、DLG1和PBK在細(xì)胞膜上共定位。這些發(fā)現(xiàn)表明CLDN6在體內(nèi)誘導(dǎo)鐵死亡，并抑制NRF2和GPX4的表達(dá)。

研究結(jié)論

本研究揭示了CLDN6在乳腺癌中鐵死亡中的關(guān)鍵作用及其潛在機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，CLDN6通過招募DLG1/PBK復(fù)合體并調(diào)節(jié)PBK依賴的AKT/GSK3β/FYN軸，增強(qiáng)NRF2的核輸出，從而觸發(fā)NRF2介導(dǎo)的鐵死亡。此外，CLDN6與鐵死亡的整合在預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后方面表現(xiàn)出顯著的性能，為乳腺癌的預(yù)后評估和治療選擇提供了新的生物標(biāo)志物。研究還表明，CLDN6通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑將PBK招募至細(xì)胞膜，并與DLG1/PBK復(fù)合體結(jié)合，促進(jìn)PBK的降解。這些發(fā)現(xiàn)不僅為理解CLDN6在乳腺癌中的作用提供了新的視角，還為開發(fā)針對鐵死亡的治療策略提供了理論基礎(chǔ)。

Qi D, Lu Y, Qu H, Dong Y, Jin Q, Sun M, Quan C. CLDN6 triggers NRF2-mediated ferroptosis through recruiting DLG1/PBK complex in breast cancer. Cell Death Dis. 2025 Feb 21;16(1):122. doi: 10.1038/s41419-025-07448-9. PMID: 39984471; PMCID: PMC11845765.