【研究背景】

胚胎植入是懷孕的關(guān)鍵步驟，發(fā)生在子宮內(nèi)膜處于“植入窗口期”時(shí)，此時(shí)子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎具有最高的接受性。這一過(guò)程受卵巢類固醇激素（雌二醇和孕酮）的調(diào)控。然而，不孕問(wèn)題影響了眾多夫婦，盡管體外受精-胚胎移植技術(shù)已經(jīng)發(fā)展，但成功率仍然只有大約30%，失敗的原因主要與胚胎植入有關(guān)。因此，深入理解胚胎植入的分子機(jī)制對(duì)于提高不孕治療的成功率至關(guān)重要。糖基化作為蛋白質(zhì)的一種重要翻譯后修飾，其在細(xì)胞間相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用，尤其是在胚胎植入過(guò)程中，特定的糖鏈結(jié)構(gòu)可能與胚胎與子宮內(nèi)膜的相互識(shí)別和附著密切相關(guān)。

【研究結(jié)果】

1. STs和FUTs在人月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)

為了闡明人子宮內(nèi)膜中STs和FUTs基因家族在月經(jīng)周期中的變化，從基因表達(dá)綜合庫(kù)（GEO）下載的兩個(gè)獨(dú)立的微陣列數(shù)據(jù)集（GSE4888和GSE6364）。GSE4888含有增殖期（PE）、早期分泌期（ESE）、中期分泌期（MSE）和晚期分泌期（LSE）子宮內(nèi)膜。GSE6364含有PE、ESE和MSE子宮內(nèi)膜。對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集的分析一致地顯示，8個(gè)糖極化相關(guān)基因（FUT2、FUT4、FUT8、ST3GAL1、ST3GAL6、ST6GAL1、ST6GAL2、ST6GALNAC1）在整個(gè)月經(jīng)周期中發(fā)生變化。與PE相比，MSE中FUT2、FUT4、ST3GAL1、ST3GAL6、ST6GAL1和ST6GALNAC1顯著增加，而與PE相比，MSE中FUT8和ST6GAL2顯著降低。

為了進(jìn)一步明確這些糖基化基因在人類子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況，我們從GSO數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE111976數(shù)據(jù)集（scRNA-Seq），展示了七種子宮內(nèi)膜細(xì)胞類型。顯示了上皮細(xì)胞（CDH1和EPCAM）、基質(zhì)成纖維細(xì)胞（COL1A1和COL3A1）和內(nèi)皮細(xì)胞（PECAM1和CD34）的代表性生物標(biāo)志物。結(jié)果顯示FUT2、ST3GAL6和ST6GALNAC1在子宮內(nèi)膜上皮中高度表達(dá)。本研究主要關(guān)注上皮細(xì)胞與胚胎的貼壁，并對(duì)ST6GALNAC1是否調(diào)控分泌期子宮上皮細(xì)胞的接受功能進(jìn)行了研究。

2. ST6GALNAC1和sTn在人子宮內(nèi)膜中的表達(dá)

為了驗(yàn)證生物信息學(xué)分析結(jié)果，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)人子宮內(nèi)膜組織中的ST6GALNAC1表達(dá)，主要定位于人子宮內(nèi)膜的腔上皮（LE）和腺上皮（GE）中。我們還發(fā)現(xiàn)sTn在分泌期的人子宮內(nèi)膜的LE和GE中深度濃縮。同時(shí)，定量分析結(jié)果顯示分泌期子宮內(nèi)膜中ST6GALNAC1和sTn水平顯著高于增殖期。

通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)揭示了P4在人子宮內(nèi)膜細(xì)胞中通過(guò)PR-A上調(diào)ST6GALNAC1表達(dá)的機(jī)制。首先，通過(guò)模擬月經(jīng)周期中增殖期（E2，雌二醇）和分泌期（E2+P4，P4即孕酮）的內(nèi)部環(huán)境，發(fā)現(xiàn)E2單獨(dú)處理對(duì)ST6GALNAC1轉(zhuǎn)錄物水平無(wú)顯著影響，而E2聯(lián)合P4處理顯著上調(diào)其表達(dá)。接著，通過(guò)構(gòu)建PR-A和PR-B質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)只有PR-A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在P4處理后ST6GALNAC1轉(zhuǎn)錄物水平顯著增加，表明PR-A參與調(diào)控ST6GALNAC1表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)siRNA驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)PR siRNA顯著減弱P4/PR-A介導(dǎo)的ST6GALNAC1表達(dá)，而PR-B siRNA無(wú)影響，進(jìn)一步證實(shí)PR-A的作用。最后，通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)P4處理后PR與ST6GALNAC1啟動(dòng)子中的PRE結(jié)合，啟動(dòng)其表達(dá)。綜上所述，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明P4通過(guò)PR-A直接調(diào)控ST6GALNAC1在人子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的表達(dá)。

3. ST6GALNAC1過(guò)表達(dá)升高sTn促進(jìn)AN3CA細(xì)胞的感受性

進(jìn)一步探討ST6GALNAC1過(guò)表達(dá)對(duì)AN3CA細(xì)胞感受性的影響。首先，利用慢病毒介導(dǎo)的ST6GALNAC1過(guò)表達(dá)細(xì)胞（LV-ST6OE），發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組（LV-NC）相比，LV-ST6OE細(xì)胞中sTn水平升高。接著，通過(guò)體外植入模型實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LV-ST6OE細(xì)胞對(duì)JAR-球狀體的接受潛力比載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞增加了2.5倍。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，用特異性抗體阻斷LV-ST6OE細(xì)胞中的sTn，發(fā)現(xiàn)這種增強(qiáng)的感受性顯著減弱，而載體組中sTn抗體處理未見(jiàn)顯著變化，可能與AN3CA細(xì)胞中sTn含量低有關(guān)。綜上所述，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ST6GALNAC1過(guò)表達(dá)通過(guò)升高sTn水平，顯著增強(qiáng)了AN3CA細(xì)胞對(duì)JAR-球狀體的接受潛力。

4. 人子宮內(nèi)膜細(xì)胞sTn修飾糖蛋白的鑒定

為了揭示ST6GALNAC1在人子宮內(nèi)膜細(xì)胞中通過(guò)sTn修飾整合素b1和CD44，進(jìn)而影響上皮-胚胎附著的機(jī)制。首先，通過(guò)免疫沉淀（IP）和LC-MS/MS分析，從ST6GALNAC1過(guò)表達(dá)的AN3CA細(xì)胞中鑒定出60種蛋白質(zhì)，其中18種為分泌蛋白或細(xì)胞膜蛋白。重點(diǎn)關(guān)注了兩種粘附分子——整合素b1和CD44，因?yàn)樗鼈儗?duì)上皮-胚胎相互作用至關(guān)重要且已被報(bào)告為sTn攜帶者。接著，通過(guò)qPCR和Western blot驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，ST6GALNAC1過(guò)表達(dá)顯著下調(diào)整合素b1的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平，而對(duì)CD44的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平無(wú)顯著影響。然而，免疫沉淀和反向IP實(shí)驗(yàn)顯示，ST6GALNAC1過(guò)表達(dá)顯著增加了整合素b1和CD44的sTn修飾水平。此外，微陣列數(shù)據(jù)分析表明，CD44在窗口期（WOI）的表達(dá)顯著增強(qiáng)，而整合素b1的表達(dá)直到分泌晚期才發(fā)生變化。綜上所述，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ST6GALNAC1通過(guò)sTn修飾整合素b1和CD44，可能在上皮-胚胎粘附過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中sTn修飾的CD44可能在窗口期對(duì)上皮-胚胎粘附尤為重要。

5. 子宮內(nèi)膜sTn修飾的CD44與滋養(yǎng)層細(xì)胞Siglec-6結(jié)合

深入探討滋養(yǎng)層細(xì)胞中Siglec-6與子宮內(nèi)膜sTn修飾的CD44之間的相互作用及其在胚胎著床中的作用。首先，通過(guò)分析已發(fā)表的單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-Seq）數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)SIGLEC6在極性滋養(yǎng)外胚層（pTE）細(xì)胞中與多個(gè)標(biāo)志物基因（如CCR7、CYP19A1和DLX5）共表達(dá)，這些細(xì)胞負(fù)責(zé)與子宮內(nèi)膜上皮直接接觸。進(jìn)一步的細(xì)胞命運(yùn)軌跡分析也顯示SIGLEC6在滋養(yǎng)外胚層（TE）中表達(dá)。接著，利用永生化的正常人滋養(yǎng)層HTR-8/SVneo細(xì)胞模型，通過(guò)慢病毒系統(tǒng)過(guò)表達(dá)Siglec-6，并驗(yàn)證其轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達(dá)。體外植入實(shí)驗(yàn)表明，Siglec-6過(guò)表達(dá)的滋養(yǎng)層細(xì)胞球狀體對(duì)ST6GALNAC1過(guò)表達(dá)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞單層的粘附率顯著增加。最后，通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用下拉實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Siglec-6能夠特異性結(jié)合子宮內(nèi)膜中sTn修飾的CD44。綜上所述，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明滋養(yǎng)層細(xì)胞中的Siglec-6可能通過(guò)與子宮內(nèi)膜sTn修飾的CD44相互作用，在胚胎著床過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

6. sTn/Siglec-G軸與小鼠胚胎著床

為了進(jìn)一步驗(yàn)證了sTn/Siglec-G軸在小鼠胚胎著床中的作用。本研究通過(guò)一系列體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，首先，通過(guò)收集非妊娠（NP）和妊娠第4天（GD4）的小鼠子宮內(nèi)膜，發(fā)現(xiàn)與NP組相比，GD4組中ST6GALNAC1和sTn水平顯著上調(diào)。接著，建立小鼠上皮子宮內(nèi)膜類器官（EEO），發(fā)現(xiàn)E2上調(diào)Lcn2和Ltf的表達(dá)，E2加P4上調(diào)Sox17和ST6GALNAC1的表達(dá)，表明P4驅(qū)動(dòng)ST6GALNAC1在鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)。免疫熒光染色顯示，ST6GALNAC1和sTn在GD4時(shí)在腔上皮上高度表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，在GD2將ST6GALNAC1 siRNA注射到小鼠子宮角中，發(fā)現(xiàn)ST6GALNAC1的敲低顯著損害胚胎植入。同樣，在GD3將抗sTn抗體注射到鼠子宮角中，發(fā)現(xiàn)阻斷sTn顯著抑制小鼠胚胎著床。鑒于小鼠不表達(dá)Siglec-6，通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)Siglec1、Siglecf和Siglecf在小鼠胚胎中表達(dá)，其中Siglecf在E3.5時(shí)表達(dá)水平較高。實(shí)驗(yàn)顯示，Siglec-G在E3.5的小鼠胚胎中表達(dá)，且注射抗Siglec-G抗體顯著抑制小鼠胚胎植入。最后，通過(guò)免疫沉淀和蛋白質(zhì)相互作用測(cè)定，證實(shí)GD4時(shí)子宮內(nèi)膜組織中的CD44含有sTn結(jié)構(gòu)，并且CD44與重組小鼠Siglec-G相互作用，抗Tn抗體可抑制這種相互作用。綜上所述，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明sTn/Siglec-G軸在小鼠胚胎著床中發(fā)揮重要作用，為理解胚胎-子宮內(nèi)膜相互作用提供了新的機(jī)制見(jiàn)解。

【研究結(jié)論】

ST6GALNAC1通過(guò)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜中sTn的修飾，特別是在CD44上，促進(jìn)了胚胎與子宮內(nèi)膜的附著。人類的Siglec-6和小鼠的Siglec-G在胚胎滋養(yǎng)層中表達(dá)，并與sTn修飾的CD44結(jié)合，從而促進(jìn)胚胎附著。這一發(fā)現(xiàn)揭示了胚胎植入過(guò)程中一個(gè)新的糖基化依賴機(jī)制，不僅增進(jìn)了我們對(duì)糖基化生物學(xué)的理解，還為生殖醫(yī)學(xué)中的診斷和治療策略提供了新的可能性。

Dong X, Wang H, Cai J, Wang Y, Chai D, Sun Z, Chen J, Li M, Xiao T, Shan C, Zhang JV, Yu M. ST6GALNAC1-mediated sialylation in uterine endometrial epithelium facilitates the epithelium-embryo attachment. J Adv Res. 2025 Jun;72:197-212. doi: 10.1016/j.jare.2024.07.021. Epub 2024 Aug 5. PMID: 39111624.